TEKNIK ISOLASI BAKTERI

Dalam kegiatan mikrobiologi pembuatan isolat dilakukan dengan cara mengambil sampel
mikrobiologi dari lingkungan yang ingin diteliti.  Dari sampel tersebut kemudian dibiakkan
dengan menggunakan media universal atau media selektif, tergantung tujuan yang ingin dicapai.
Jika menggunakan media universal akan diperoleh biakan mikroba campuran.  Untuk proses
identifikasi maupun isolasi jenis tertentu saja, dilakukan proses pembuatan isolat tunggal dari
isolat campuran tersebut. Isolat tunggal atau biakan murni merupakan biakan yang asalnya dari
pembelahan satu sel tunggal.

Ada beberapa metode untuk memperoleh biakan murni dari isolat campuran.  Dua di antaranya
yang sering digunakan adalah teknik cawan gores dan teknik cawan tuang.  Prinsip dari kedua
teknik tersebut sama, yaitu mengencerkan biakan campuran hingga setiap individu spesies dapat
dipisahkan, sehingga setiap koloni yang terbentuk merupakan hasil dari pembelahan satu sel.

a. Metode Cawan Gores Kuadran (Strike Plate)
Metode ini praktis, hemat biaya dan waktu, hanya membutuhkan keterampilan.  Hasil
penggoresan diharapkan tampak seperti gambar di bawah ini.




Kesalahan-kesalahan yang umum dilakukan dalam metode ini antara lain : (1) tidak
memanfaatkan permukaan medium untuk digores sehingga pengenceran kurang optimal, (2)
penggunaan inokulum yang terlalau banyak sehingga menyulitkan pemisahan sel waktu
digores.


b. Metode Cawan Tuang (Pour Plate)
Metode cawan tuang merupakan teknik lain yang dapat digunakan untuk mendapatkan
koloni murni mikroorganisme.  Kelemahan metode ini adalah membutuhkan waktu dan
bahan yang lama dan banyak, akan tetapi tidak memerlukan keterampilan tinggi.  Biakan
campuran diencerkan dengan menggunakan medium agar yang telah dicairkan dan
didinginkan. Pengenceran dilakukan dalam beberapa tahap hingga diperoleh koloni tunggal.

Isolasi Dengan Cara Pengenceran (Dilution)

1. Teknik Preparasi Suspensi

Sampel yang telah diambil kemudian disuspensikan dalam akuades steril. Tujuan dari teknik ini pada prinsipnya adalah melarutkan atau melepaskan mikroba dari substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. Macam-macam preparsi bergantung kepada bentuk sampel : 

 a. Swab (ulas), dilakukan menggunakan cotton bud steril pada sampel yang memiliki permukaan luas dan pada umumnya sulit dipindahkan atau sesuatu pada benda tersebut. Contohnya adalah meja, batu, batang kayu dll. Caranya dengan mengusapkan cotton bud memutar sehingga seluruh permukaan kapas dari cotton bud kontak dengan permukaan sampel. Swab akan lebih baik jika cotton bud dicelupkan terlebih dahulu ke dalam larutan atraktan semisal pepton water.

  b. Rinse (bilas) ditujukan untuk melarutkan sel-sel mikroba yang menempel pada permukaan substrat yang luas tapi relatif berukuran kecil, misalnya daun bunga dll. Rinse merupakan prosedur kerja dengan mencelupkan sampel ke dalam akuades dengan perbandingan 1 : 9 (w/v). Contohnya sampel daun diambil dan ditimbang 5 g kemudian dibilas dengan akuades 45 ml yang terdapat dalam beaker glass.

c. Maseration (pengancuran), sampel yang berbentuk padat dapat ditumbuk dengan mortar dan pestle sehingga mikroba yang ada dipermukaan atau di dalam dapat terlepas kemudian dilarutkan ke dalam air. Contoh sampelnya antar alain bakso, biji, buah dll. Perbandingan antar berat sampel dengan pengenceran pertama adalah 1 : 9 (w/v). Unutk sampel dari tanh tak perlu dimaserasi

  

1. Teknik Pengenceran Bertingkat

 

Tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan perbandingan 1 : 9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel mikroorganisma dari pengenceran sebelumnya.

Cara Kerja :

a. Sampel yang mengandung bakteri dimasukan ke dalam tabung pengenceran pertama (1/10 atau 10^-1) secara aseptis (dari preparasi suspensi). Perbandingan berat sampel dengan volume tabung pertama adalah 1 : 9 dan ingat akuades yang digunakan jika memakai teknik rinse dan swab sudah termasuk pengencer 10^-1. Setelah sampel masuk lalu dilarutkan dengan mengocoknya (pengocokan yang benar dapat dilihat pada gambar disamping)

b. Diambil 1 ml dari tabung 10^-1 dengan pipet ukur kemudian dipindahkan ke tabung 10^-2 secara aseptis kemudian dikocok dengan membenturkan tabung ke telapak tangan sampai homogen. Pemindahan dilanjutkan hingga tabung pengenceran terakhir dengan cara yang sama, hal yang perlu diingat bahwa pipet ukur yang digunakan harus selalu diganti, artinya setiap tingkat pengenceran digunakan pipet ukur steril yang berbeda/baru. Prinsipnya bahwa pipet tidak perlu diganti jika memindahkan cairan dari sumber yang sama.

3. Teknik Penanaman

a. Teknik penanaman dari suspensi

Teknik penanaman ini merupakan lajutan dari pengenceran bertingkat. Pengambilan suspensi dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi biasanya untuk tujuan isolasi (mendapatkan koloni tunggal) diambil beberapa tabung pengenceran terakhir.

a.1. Spread Plate (agar tabur ulas)

Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi bakteri di permukaan agar diperoleh kultur murni. Adapun prosedur kerja yang dapat dilakukan adalah sebagai berikut :

· Ambil suspensi cairan senamyak 0,1 ml dengan pipet ukur kemudian teteskan diatas permukaan agar yang telah memadat.

· Batang L atau batang drugal diambil kemudian disemprot alkohol dan dibakar diatas bunsen beberapa saat, kemudian didinginkan dan ditunggu beberapa detik.

· Kemudian disebarkan dengan menggosokannya pada permukaan agar supaya tetesan suspensi merata, penyebaran akan lebih efektif bila cawan ikut diputar.

· Hal yang perlu diingat bahwa batang L yang terlalu panas dapat menyebabkan sel-sel mikroorganisme dapat mati karena panas.

a.2. Pour Plate (agar tuang)

Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45^oC) untuk dituang bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh dipermukaan agar yang kaya O₂ dan ada yang tumbuh di dalam agar yang tidak banyak begitu banyak mengandung oksigen. Adapun prosedur kerja yang dilakukan adalah sebagai berikut :

_· Siapkan cawan steril, tabung pengenceran yang akan ditanam dan media padat yang masih cair (>45^oC)

_· Teteskan 1 ml secara aseptis.suspensi sel kedalam cawan kosong

_· Tuangkan media yang masih cair ke cawan kemudian putar cawan untuk menghomogenkan suspensi bakteri dan media, kemudian diinkubasi.

Alasan diteteskannya bakteri sebanyak 0,1 ml untuk spread plate dan 1 ml untuk pour plate karena spread plate ditujukan untuk menumbuhkan dipermukaanya saja, sedangkan pour plate membutuhkan ruang yang lebih luas untuk penyebarannya sehingga diberikan lebih banyak dari padaspread plate.

b. Teknik Penanaman dengan Goresan (Streak)

Bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium baru.

b.1 Goresan Sinambung

Cara kerja :

_· Sentuhkan inokulum loop pada koloni dan gores secara kontinyu sampai setengah permukaan agar.

_· Jangan pijarkan loop, lalu putar cawan 180^oC lanjutkan goresan sampai habis.

Goresan sinambung umumnya digunakan bukan untuk mendapatkan koloni tunggal, melainkan untuk peremajaan ke cawan atau medium baru.

b.2 Goresan T

Cara kerja :

_· Bagi cawan menjadi 3 bagian menggunakan spidol marker

_· Inokulasi daerah 1 dengan streak zig-zag

_· Panaskan jarum inokulan dan tunggu dingin, kemudian lanjutkan streak zig-zag pada daerah 2 (streak pada gambar). Cawan diputar untuk memperoleh goresan yang sempurna

_· Lakukan hal yang sama pada daerah 3

B.3 Goresan Kuadran (Streak quadrant)

Cara kerja :

Hampir sama dengan goresan T, namun berpola goresan yang berbeda yaitu dibagi empat. Daerah 1 merupakan goresan awal sehingga masih mengandung banyak sel mikroorganisma.Goresan selanjutnya dipotongkan atau disilangkan dari goresan pertama sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnya terpisah-pisah menjadi koloni tunggal.

Cara Kerja Isolasi Bakteri dari Sampel Tanah :

· Tanah seberat 1 g dimasukan ke dalam tabung pengenceran 10^-1secara aseptis dan selanjutnya dilakukan pengenceran bertingkat sampai 10^-8

· Tiga pengenceran terakhir diambil 0,1 ml untuk ditanam secara spread plate pada medium NA, setelah selesai, diinkubasi pada 37^oC selama 1x24 jam

· Koloni akan tumbuh pada ketiga cawan tersebut kemudian dipilih koloni yang relatif terpisah dari koloni lain dan koloni yang mudah dikenali

· Koloni yang terpilih kemudian ditumbuhkan atau dimurnikan ke NA baru dengan teknik streak kuadran

· Inkubasi 1x24 jam.

Cara Kerja Isolasi Jamur dari Tanah :

• Tanah dalam cawan petri dipanaskan dengan oven pada suhu 80^oC selama 30 menit dengan cawan petri untuk membunuh sel vegetatiftetap bertahan
• Tanah yang telah dioven diambil 1 g kemudian dimasukan ke dalam tabung pengenceran bertingkat
• Tiga pengenceran terakhir diambil untuk ditanama secara spread plateke media PDA yang ditambah streptomycin atau penicillin. Kemudian diinkubnasi pada suhu ruang 5-7 hari
• Koloni jamur yang tumbuh dimurnikan dan ditanam pada medium PDA baru,
• Inkubasi pada suhu ruang 5-7 hari.

1. Metode apa saja yang dapat digunakan untuk mengisolasi biakan murni mirkoorganisme ?
a) Metode Gores
Teknik ini lebih menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapi memerlukan ketrampilan-ketrampilan yang diperoleh dengan latihan. Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Inokulum digoreskan di permukaan media agar nutrien dalam cawaan petri dengan jarum pindah (lup inokulasi). Di antara garis-garis goresan akan terdapat sel-sel yang cukup terpisah sehingga dapat tumbuh menjadi. Cara penggarisan dilakukan pada medium pembiakan padat bentuk lempeng. Bila dilakukan dengan baik teknik inilah yang paling praktis. Dalam pengerjaannya terkadang berbeda pada masing-masing laboratorium tapi tujuannya sama yaitu untuk membuat goresan sebanyak mungkin pada lempeng medium pembiakan.

c) Metode tuang
Isolasi menggunakan media cair dengan cara pengenceran. Dasar melakukan pengenceran adalah penurunan jumlah mikroorganisme sehingga pada suatu saat hanya ditemukan satu sel di dalam tabung. 

Persyaratan utama bagi isolasi dan kultivasi fage adalah harus adanya kondisi optimum untuk pertumbuhan organisme inangnya. Sumber bakteriofage yang paling baik dan paling utama adalah habitat inang. Sebagai contoh fage koli yang di jumpai di dalam pencernaan dapat diisolasi dari limbah atau pupuk kandang. Hal ini dilakukan dengan sentifugasi atau filtrasi bahan sumbrnya dan penambahan kloroform untuk membunuh sel-sel bakterinya (Adams, 2000).
Ada beberapa metode yang digunakan untuk mengisolasi bakteri, fungi, dan khamir dengan menggunakan metode gores, metode tuang, metode sebar, metode pengenceran serta micromanipulator. Dua diantaranya yang paling sering digunakan adalah tekhnik cawan tuang dan cawan gores. Kedua metode ini didasarkan pada prinsip yang sama yaitu mengencerkan organisme sedemikian rupa sehingga individu spesies individu spesies dapat dipisahkan dari lainnya.
Mikroorganisme dibiakkan di laboratorium pada medium yang terdiri dari bahan nutrient. Biasanya pemilihan medium yang dipakai bergantung kepada banyak faktor seperti seperti apa jenis mikroorganisme yang akan ditumbuhkan (Pelezar, 1986).
Perbenihan untuk pertumbuhan bakteri agar dapat tetap dipertahankan harus mengandung semua zat makanan yang diperlukan oleh organisme tersebut. Faktor lain seperti PH, suhu, dan pendinginan harus dikendalikan dengan baik (Buckle, 1987)

 

 

http://semuaberitaku.blogspot.com/2012/10/definisi-prinsip-kelebihan-dan.html//lfan munandar on Wednesday, October 10, 2012//15 januari 2014